Применение флуоресценции 

Флуоресценция — это высокочувствительный метод обнаружения ДНК, РНК или белков. Вы можете либо связать флуоресцентные молекулы непосредственно с нуклеиновыми кислотами или белками, либо, как альтернатива белкам, прикрепить флуорофор к вторичному или третичному антителу, которое связывается с вашим целевым белком. Чтобы визуализировать флуоресцентные молекулы, необходимо возбудить их с помощью источника света высокой интенсивности, например, ультрафиолетового, RGB или инфракрасного света. При возбуждении флуорофор генерирует световое излучение в виде многих тысяч детектируемых фотонов, которые можно зафиксировать с помощью CCD-камеры. Поскольку флуоресцентные молекулы производят так много фотонов света, при использовании правильных типов технологий захвата изображения можно обнаружить нуклеиновые кислоты и белки на уровне пикограмм и фемтограмм. Кроме того, поскольку каждый тип флуорофора излучает свет разного цвета, вы можете использовать несколько флуоресцентных молекул одновременно для обнаружения множества отдельных целевых белков на одном геле.

Гели для ДНК/РНК/белков

Для визуализации ДНК или РНК на гелях традиционно используется бромистый этидий. Он связывается с нуклеиновыми кислотами и дает флуоресценцию под действием ультрафиолетового света. Для более безопасной визуализации ДНК можно выбрать менее опасные красители, такие как SYBR® Safe, SYBR® Gold, GelRed™, GelGreen™ и SYBR® Green, которые флуоресцируют синим светом.

Вместо использования Coomassie Blue можно выбрать AzureRed, Coomassie™ Fluor Orange, SYPRO® Ruby и SYPRO® Red для окрашивания белков. Они связываются с общим белком и дают флуоресценцию в ультрафиолетовом или синем свете, и вы можете определить количественные данные по вашим полосам, включив в них белковые стандарты.

С помощью систем Syngene NuGenius, InGenius, G:BOX или G:BOX mini вы можете легко визуализировать все эти красители. Используя УФ-трансиллюминатор и экран преобразователя УФ-синего света или трансиллюминатор синего света, вы можете получить изображение флуоресцентной ДНК, РНК или белка за считанные секунды, а когда вам нужно вырезать полосы из геля, трансиллюминатор просто выдвигается для легкого доступа.

Если вы не хотите выполнять трудоемкие операции по окрашиванию и обесцвечиванию для визуализации белков, вы можете использовать набирающие популярность гели Stain-Free™. Эти гели содержат в своей матрице соединение, которое связывается с остатками триптофана в белке и генерирует флуоресценцию под воздействием ультрафиолетового света.

Системы Syngene NuGenius+, G:BOX или G:BOX mini были оптимизированы для быстрой и простой визуализации гелей Stain-Free™. Используя опции освещения УФ-трансиллюминатора, программное обеспечение каждой системы подберет для вас подходящие условия визуализации, чтобы каждый раз получать отличные результаты.

Бромистый этидий, связанный с ДНК.

Бромистый этидий интеркалирует между основаниями ДНК и удлиняет спираль ДНК. Для визуализации бромистого этидия необходим источник ультрафиолетового возбуждения.

Вестерн-блоттинг

При флуоресцентном вестерн-блоттинге вы можете присоединить флуорофор, такой как Alexa Fluor®, IRDye®, DyLight™ или Qdot®, к вторичному или третичному антителу, которое связывается с вашим целевым белком. Поскольку эти красители излучают свет разного цвета при интенсивном УФ, RGB или ИК освещении, вы можете использовать несколько флуоресцентных молекул одновременно для визуализации нескольких различных белков на одном блоте. Это обеспечивает гибкость мультиплексного анализа без потери сигнала из-за снятия и повторного зондирования блота, а поскольку флуоресцентные сигналы обладают большей стабильностью во времени, результаты получаются линейными и более точными.

Прямое обнаружение первичных и вторичных антител.

Первичное антитело (1°) связывается с целевым белком на мембране. Затем мембрана инкубируется со вторичным антителом (2°), конъюгированным с флуорофором. Мембрана визуализируется с помощью Hi-LED источника света, который возбуждает флуорофор и генерирует флуоресценцию, которая фиксируется CCD-камерой.

Мультиплексные белковые гели

Чтобы не переносить белки на вестерн-блот, вы можете использовать вторичные антитела, меченные теми же красителями, которые вы используете для флуоресцентного вестерн-блоттинга, непосредственно в геле для связывания с любым антителом, связанным с вашими целевыми белками. Красители флуоресцируют при RGB или ИК освещении, поэтому вы можете обнаружить слитые белки и белок-белковые взаимодействия, а также взаимодействия белок-ДНК или белок-РНК непосредственно в геле.

Используя специальные фильтры и опции HI-LED RGB и IR освещения, вы можете быстро получить изображение мультиплексных флуоресцентных белков на вестерн-блотах или в гелях с помощью систем Syngene G:BOX или G:BOX mini. Программное обеспечение GeneSys автоматически выбирает наилучшую комбинацию освещения и фильтров для изображения каждого красителя. Затем вы можете получить одно или несколько изображений вашего пятна или геля и наложить на них изображения разных цветов. Это означает, что вы можете получить одно полное изображение всех различных флуоресцентных белков, без необходимости снимать и заново зондировать пятно, что делает визуализацию и точный анализ каждого белка простой задачей.

Мультиплексный флуоресцентный вестерн-блоттинг.

Флуоресцентный мультиплекс между двумя различными флуорофорами. Первичные антитела (1°) связываются с целевыми белками на мембране. Затем мембрана инкубируется с вторичными антителами (2°), конъюгированными с различными флуорофорами. Затем мембрана визуализируется с помощью Hi-LED источников света, которые возбуждают каждый флуорофор по отдельности и генерируют флуоресценцию для каждого флуорофора, которая фиксируется CCD-камерой.