Здесь теория. Вы также можете перейти к выбору приборов из этого раздела.
Что такое микродиализ? 
Микродиализ — это хорошо зарекомендовавшая себя техника отбора проб внеклеточного пространства in vivo в течение определенного периода времени. Он идеально подходит для получения данных о локальных концентрациях нескольких нейротрансмиттеров, нейромодуляторов или белков при том или ином поведении животных.
Компания Amuza работает с микродиализом уже несколько десятилетий, как поддерживая продукцию Eicom, так и производя собственную. Уникальная среди компаний, занимающихся микродиализом, Amuza может создать всю систему микродиализа, от зондов и насосов для микродиализа до автоматизированных систем ВЭЖХ для анализа. Цель фирмы — оптимизировать и автоматизировать ваши проекты, чтобы вы могли быстро получить необходимые данные без потери времени на устранение неполадок.
Зонд для микродиализа имплантируется в целевую ткань мозга исследуемого животного. Перфузат, имитирующий внеклеточную жидкость, медленно прокачивается через микродиализный зонд. На конце зонда имеется мембрана, которая позволяет внеклеточным молекулам диффундировать в перфузат. Перфузат выходит из зонда и собирается для нейрохимического анализа. Подробное описание можно найти ниже.
Идеальная система микродиализа in vivo включает в себя следующее:
Процентное восстановление зависит от оптимизации ряда условий для анализа конкретных молекул. Например, если вы хотите анализировать нейропептиды из участка мозга диаметром 3 мм, то мембрана на зонде для микродиализа должна иметь большой размер пор, а длина мембраны должна быть аналогичного диаметра. Другие факторы, такие как скорость потока, выбор перфузионной жидкости, длина мембраны, тип мембраны, длина трубки, противодавление и т.д., также должны быть оптимизированы.
Образцы для микродиализа называют микродиализатом или просто диализатом. Микродиализат собирается либо вручную, либо предпочтительным методом — с помощью коллектора фракций. Образец подготавливается для анализа с помощью различных детекторов, включая, но не ограничиваясь, УФ, ECD и масс-спектрометром. Более подробная информация приведена ниже.
Зонд для микродиализа представляет собой небольшой Y-образный катетер, содержащий входное и выходное отверстия с волокнистой полупроницаемой мембраной на нижнем конце. Зонд для микродиализа осторожно вводится через предварительно хирургически имплантированную направляющую канюлю, чтобы мембрана уперлась в нужную ткань мозга. Перфузат, имитирующий внеклеточную жидкость (раствор Рингера или искусственная спинномозговая жидкость, aCSF), прокачивается через входную сторону зонда. Содержащиеся во внеклеточной жидкости растворители, такие как нейротрансмиттеры (серотонин, дофамин, норэпинефрин, ацетилхолин, ГАМК, гистамин, глутамат, глицин и метаболиты), цитокины, белки и нейропептиды, пассивно диффундируют через мембрану и переносятся перфузатом через выходной порт. Образцы собираются через определенные промежутки времени для нейрохимического анализа.
Прочитав об идеальной системе Eicom, вы, возможно, заметили некоторые интересные особенности. Во-первых, зачем нужна вращающаяся клетка? Во-вторых, зачем еще один насос для больших молекул? Чтобы ответить на эти вопросы, мы должны вспомнить о базовой установке для микродиализа.
Для каждого микродиализного зонда есть две тонкие трубки, необходимые для передачи aCSF к зонду и от него. Поскольку животное находится в свободном движении, простое подсоединение трубок непосредственно к животному означает, что трубки будут перекручиваться при вращении животного. Это чревато отсоединением линий или ограничением способности животного двигаться. Для предотвращения скручивания линий микродиализа часто используются жидкостные вертлюги, но они становятся громоздкими по мере присоединения к животному большего количества линий (трубчатых, оптоволоконных или электрических). Поэтому мы подумали, как предотвратить скручивание линий независимо от того, сколько линий подсоединено к животному. Нам показалось, что решение заключается в том, чтобы бороться со скручиванием у источника: животного, которое продолжает вращаться. Некоторые исследователи тратят время на раскручивание животного вручную, мы же подумали, почему бы машине не сделать это за нас? Таким образом, мы получили вращающуюся клетку. Когда животное вращается, привязь закручивает датчик, который заставляет платформу вращаться в обратном направлении. В результате животное совершает ноль чистых оборотов, поэтому не нужно беспокоиться о скручивании. Лучше всего, если несколько имплантатов и трубопроводов не перекручиваются. Кроме того, больше не нужно чистить вертлюги!
Итак, зачем нужен второй насос? Короткий ответ — для устранения противодавления в выходной линии. Длинный ответ заключается в том, что иногда исследователи стремятся собрать большие молекулы, а это означает, что требуется мембрана с большими порами. Большие поры означают, что при наличии противодавления больше жидкости будет проникать через мембрану и попадать в мозг, что может привести к повышению внутричерепного давления и снижению скорости восстановления. Добавляя второй насос, мы создаем систему "толкай-тяни". Чтобы скорректировать даже малейшую разницу в давлении между насосами, мы добавили вентиляционное отверстие в зонды AtmosLM™. Это устраняет любое повышение давления в зонде и, следовательно, предотвращает утечку мембраны в мозг.
Процент извлечения зависит от нескольких факторов, таких как скорость диффузии, скорость потока, поток, длина мембраны, тип мембраны/размер пор и перфузионная жидкость. Для достижения наилучших результатов требуется оптимизация каждого фактора. Например, при самой низкой скорости потока, самой длинной мембране и максимальном времени отбора проб будут получены образцы с самой высокой концентрацией аналита. Это объясняется тем, что мембрана максимизирует площадь поверхности для диффузии, а медленная скорость потока дает диффузии достаточно времени для уравновешивания; время отбора проб определяет абсолютное содержание аналита в каждой пробе. Этот пример упрощает понимание факторов, которые необходимо учитывать.
Диффузия: Скорость диффузии обратно пропорциональна размеру молекул. Это означает, что при увеличении молекулярного веса аналита скорость диффузии уменьшается. Если скорость диффузии уменьшается, то процент восстановления снижается. Это, по сути, заставляет снижать скорость потока для больших молекул. Далее, гидрофобность также играет роль в скорости диффузии и должна учитываться при анализе больших молекул, таких как нейропептиды. Гидрофобные молекулы также обладают "липкими" свойствами, что затрудняет мониторинг изменений концентрации (в первую очередь, снижения), поскольку эти изменения требуют значительно больше времени для уравновешивания. Концентрация целевого аналита может быть истощена из области вокруг зонда быстрее, чем он может поступить в клетки или диффундировать из окружающей внеклеточной жидкости; это частично объясняется тем, что диффузия в ткани занимает больше времени, чем в водных растворах, из-за ограниченности внеклеточной жидкости и непрямых путей диффузии между клетками. Аналиты могут прикрепляться к клеткам по пути и замедлять их диффузию; результаты могут быть неверно истолкованы, если этот принцип не учитывается в ходе исследования.
Скорость потока и поток: Низкая скорость потока создает низкое давление в зонде; при использовании перфузионной жидкости, имитирующей внеклеточную жидкость, помимо низкого давления, существует минимальный ионный поток между зондом и мозгом, что положительно влияет на диффузию. Принцип потока позволяет оценить внеклеточные концентрации целевого аналита. Для этого в перфузат добавляют известную концентрацию целевого аналита, а затем прокачивают через зонд. Диализат анализируется на разницу в концентрации; снижение концентрации аналита в диализате показывает, что внеклеточная жидкость имеет более низкую концентрацию аналита, следовательно, аналит диффундировал из перфузата во внеклеточную жидкость. Если концентрация аналита в диализате оказалась выше его исходной концентрации, то можно сделать вывод, что концентрация аналита во внеклеточной жидкости выше, следовательно, аналит диффундировал из внеклеточной жидкости в перфузат. Регулируя концентрацию аналита в перфузате до отсутствия разницы в концентрации аналита между перфузатом и диализатом, можно сделать вывод об отсутствии чистой диффузии аналита через мембрану, поэтому мы оценили концентрацию аналита во внеклеточной жидкости. Оптимизация этих факторов позволяет нам более точно определить/вычислить абсолютное содержание целевой молекулы у поверхности зонда.
Перфузионная жидкость: Перфузионная жидкость должна быть как можно ближе по своей природе к внеклеточной жидкости. Это делается для того, чтобы ограничить ионный перенос через мембрану, который может повлиять на скорость диффузии. Многие используют раствор Рингера (148 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 3 мМ CaCl2), который имеет более высокий уровень кальция и калия, чем aCSF (148 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1,2 мМ CaCl2, 0,85 мМ MgCl2). Раствор aCSF более точно имитирует физиологические солевые условия in-vivo, что позволяет получать более точные показания от животного. Для микродиализа крупных молекул можно добавить осмотический агент, такой как БСА (бычий сывороточный альбумин), чтобы ограничить потерю жидкости через мембраны с крупными порами. BSA также служит блокирующим агентом, предотвращая неспецифическую адсорбцию других пептидов и белков на поверхности зонда и трубки.
Зонд для микродиализа: Как упоминалось выше, длина мембраны и размер пор играют важную роль в скорости восстановления. Размер пор определяется выбором материала, из которого изготовлена мембрана; в зависимости от области применения (пептиды или моноамины) можно выбрать несколько вариантов материала мембраны. Некоторые типы мембран — регенерированная целлюлоза, полиакрилонитрил, полиэтилен и полиэфирсульфон. Длина мембраны не должна превышать диаметр целевой ткани мозга. Большинство мембран будут хорошо работать для веществ с низким молекулярным весом, но по мере увеличения молекулярного веса размер пор становится значительно важнее.
Трубки: Чтобы избежать слишком большого противодавления после зонда микродиализа, необходимо тщательно продумать длину трубки. Если длина трубки слишком велика, противодавление из линии может привести к повреждению невентилируемых зондов и травмированию животного. Решением проблемы является уменьшение длины трубки между зондом микродиализа и коллектором или добавление насоса, который будет отводить жидкость от зонда и полностью устранять давление. Добавление второго насоса — это то, что мы сделали для наших зондов AtmosLM™. Если второй насос невозможен, то ограничение трубки не только минимизирует противодавление, но и сокращает время транспортировки от мозга до коллектора, где образец может быть охлажден. К сожалению, увеличение диаметра трубки не подходит, поскольку это увеличит диффузию аналитов во время транспортировки и затруднит точное определение изменений концентрации. Трубки большого диаметра также увеличивают время транспортировки и риск деградации. Это подводит нас к следующему пункту.
Сбор и анализ образцов: После того как образец для микродиализа собран через зонд, он может быть введен непосредственно (on-line) в установку высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или отобран в 96-луночный планшет через коллектор фракций, где он охлаждается для последующего анализа (off-line). В зависимости от интересующих аналитов могут использоваться различные аналитические методы. Наиболее часто используются ВЭЖХ и ИФА. Для моноаминов обычно используют ВЭЖХ-ЭХД (электрохимический детектор) или масс-спектрометрию. Масс-спектрометрия обычно используется при проведении неспецифического анализа, поскольку она позволяет анализировать широкий спектр молекул одновременно. Недостатки связаны с ценой прибора или даже с оплатой анализа образцов. ВЭЖХ-ECD является гораздо менее дорогим прибором, но при этом обладает чувствительностью, позволяющей определять неврологические концентрации аналитов. ВЭЖХ-ECD можно легко и быстро настроить для анализа конкретных молекул в большинстве лабораторий с высокой чувствительностью. ВЭЖХ также не требует такого большого опыта для анализа результатов по сравнению с масс-спектрометром, что делает его простым в эксплуатации с минимальным обучением.
Общие затраты на проведение анализа проб становятся в разы дешевле по сравнению с масс-спектрометрией. Кроме того, из-за низкой стоимости прибора и затрат на обслуживание многие исследователи предпочитают возможность немедленного анализа микродиализата, что делает его одним из главных претендентов на звание "must-have" в лаборатории неврологии. Компания Eicom разработала всю установку, которая, возможно, является самой удобной системой для использования нейробиологами, сделав коллектор фракций совместимым с фирменным автосамплером ВЭЖХ. Просто возьмите 96-луночный планшет из коллектора фракций и поместите его в автосамплер, создайте последовательность и нажмите старт. Хотя электрохимический детектор не предназначен для очень больших молекул, ВЭЖХ можно настроить на использование нескольких типов детекторов, что делает ее еще более универсальной для многих областей исследований.
Некоторые исследователи используют ретродиализ для доставки соединения в целевую ткань мозга. Это соединение может быть лекарством, токсином, белком и т.д. Этот обратный тип микродиализа называется ретродиализом и применяется, когда необходимо точное введение соединения. Соединение помещается в перфузат и диффундирует через мембрану в ткань-мишень. Например, если поместить лекарство в перфузат, оно будет диффундировать через мембрану микродиализного зонда, имплантированного непосредственно в опухоль. Второй микродиализный зонд может быть размещен рядом с первым зондом и собирать диализат в ответ на введение лекарства.
Некоторые исследователи предпочитают проводить двусторонний микродиализ. Один зонд функционирует как базовый, в то время как с другим зондом проводятся определенные манипуляции.
Склад
Каталог
О компании
Услуги
Новости
Контакты
Партнеры
конкурентные цены
