Выделение ДНК — особенности распространенных методов 

Впервые выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) было осуществлено в 1869 году Фридрихом Мишером. В настоящее время это рутинная процедура в молекулярной биологии или судебно-медицинском анализе. Для химического метода существует множество различных наборов, используемых для экстракции, и выбор правильного набора позволит сэкономить время на оптимизации процедуры экстракции. Определение чувствительности ПЦР рассматривается для того, чтобы показать различия между коммерческими наборами.

Основная процедура

Клетки, подлежащие изучению, необходимо собрать.

Далее необходимо произвести разрыв клеточных мембран, чтобы обнажить ДНК вместе с цитоплазмой внутри (лизис клеток).

Липиды клеточной мембраны и ядра разрушаются с помощью детергентов и поверхностно-активных веществ.

Разрушение белков путем добавления протеазы (необязательно).

Расщепление РНК путем добавления РНКазы (необязательно).

Раствор обрабатывается концентрированным солевым раствором (физраствором), чтобы заставить мусор, такой как разрушенные белки, липиды и РНК, слипнуться вместе.

Центрифугирование раствора, которое отделяет слипшиеся клеточные остатки от ДНК.

Очистка ДНК от детергентов, белков, солей и реагентов, использованных на этапе лизиса клеток. Наиболее часто используемыми процедурами являются:

Осаждение этанолом, обычно ледяным этанолом или изопропанолом. Поскольку ДНК нерастворима в этих спиртах, при центрифугировании она объединяется, образуя гранулы. Осаждение ДНК улучшается при увеличении ионной силы, обычно при добавлении ацетата натрия.

Фенол-хлороформная экстракция, при которой фенол денатурирует белки в образце. После центрифугирования образца денатурированные белки остаются в органической фазе, а водная фаза, содержащая нуклеиновую кислоту, смешивается с хлороформом для удаления остатков фенола из раствора.

Очистка с помощью мини-колонок, которая основана на том, что нуклеиновые кислоты могут связываться (адсорбция) с твердой фазой (кремнеземом или другой) в зависимости от pH и концентрации соли в буфере.

Клеточные и гистоновые белки, связанные с ДНК, могут быть удалены либо добавлением протеазы, либо осаждением белков ацетатом натрия или аммония, либо экстрагированием их смесью фенол-хлороформ до выделения ДНК.

После выделения ДНК растворяют в слабощелочном буфере, обычно в ТЕ-буфере, или в сверхчистой воде.

Выбор метода

Некоторые из наиболее распространенных методов выделения ДНК включают органическую экстракцию, экстракцию Хелекса и твердофазную экстракцию. Эти методы неизменно дают выделенную ДНК, но они отличаются как по качеству, так и по количеству полученной ДНК. При выборе метода выделения ДНК необходимо учитывать множество факторов, включая стоимость, время, безопасность и риск загрязнения.

Органическая экстракция включает в себя добавление и инкубацию в нескольких различных химических растворах; включая этап лизиса, экстракцию фенол-хлороформом, осаждение этанолом и этап промывки. Органическая экстракция часто используется в лабораториях, поскольку она дешева и позволяет получить большое количество чистой ДНК. Хотя этот метод прост, он включает много этапов и занимает больше времени, чем другие методы. Он также связан с использованием токсичных химических веществ — фенола и хлороформа, и существует повышенный риск загрязнения из-за переноса ДНК между несколькими пробирками. Несколько протоколов, основанных на органической экстракции ДНК, были эффективно разработаны несколько десятилетий назад, хотя в последние годы были разработаны и опубликованы улучшенные и более практичные версии этих протоколов.

Метод экстракции Chelex включает добавление смолы Chelex к образцу, кипячение раствора, затем его вихревое перемешивание и центрифугирование. Клеточные материалы связываются с бусинками Chelex, а ДНК можно получить в супернатанте. Метод Chelex намного быстрее и проще, чем органическая экстракция, и для него требуется только одна пробирка, что снижает риск загрязнения ДНК. К сожалению, экстракция Chelex не дает такого большого количества ДНК, и полученная ДНК является одноцепочечной, что означает, что ее можно использовать только для анализа на основе ПЦР, но не для RFLP.

Твердофазная экстракция, например, с использованием метода экстракции на основе спин-колонки, использует тот факт, что ДНК связывается с кремнеземом. Образец, содержащий ДНК, добавляют в колонку, содержащую силикагель или силикатные бусины и хаотропные соли. Хаотропные соли нарушают водородную связь между нитями и облегчают связывание ДНК с кремнеземом, заставляя нуклеиновые кислоты становиться гидрофобными. Это обнажает фосфатные остатки, и они становятся доступными для адсорбции. ДНК связывается с кремнеземом, а остальная часть раствора промывается этанолом для удаления хаотропных солей и других ненужных компонентов. Затем ДНК может быть регидратирована водным раствором с низким содержанием солей, что позволяет элюировать ДНК с бусин.

Этот метод позволяет получить высококачественную, в основном двухцепочечную ДНК, которая может быть использована как для ПЦР, так и для RFLP-анализа. Эта процедура может быть автоматизирована и имеет высокую пропускную способность, хотя и меньшую, чем фенол-хлороформный метод. Это одноэтапный метод, т.е. вся процедура выполняется в одной пробирке. Это снижает риск загрязнения, что делает его очень полезным для криминалистической экстракции ДНК. Многочисленные коммерческие наборы для твердофазной экстракции производятся и продаются различными компаниями; единственная проблема заключается в том, что они дороже, чем органическая экстракция или экстракция Chelex.

В «Биотехнологии» вы можете купить компактную настольную роботизированную систему для выделения и очистки нуклеиновых кислот из различных типов образцов, основанную на адсобции ДНК/РНК на магнитных частицах MagCore®. Эти системы производит компания RBC Bioscience. С такой системой экстракция ДНК становится простой задачей и не требует специальных навыков.